Gram stain มีการค้นพบครั้งแรก โดย  Karl Friedlander และ มีการพัฒนาต่อจนถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลาย โดย  Hans Christian  Gram  ในปี พ.ศ. 2427 รวมแล้วนานกว่า 130ปี วิธีนี้แยกแบคทีเรียออกเป็น 2 กลุ่ม ได้แก่ Gram negative เป็นแบคทีเรียที่มีสาร Peptidoglycan เคลือบอยู่บนผิวแบบบางๆ จึงถูกล้างออกได้ง่าย โดย Alcohol acetone ดังนั้น สีที่ย้อมเซลล์  (dye iodine complex) จึงหลุดออกมาด้วย จึงทำให้ผนังเซลล์ติดสีชมพู ขณะที่แบคทีเรียกลุ่ม Gram positive มี peptidoglycan เคลือบอยู่บนผิวหนามากล้างออกไม่ได้ด้วย Alcohol acetone เซลล์จึงติดสีม่วงเข้มของ  dye iodine complex

                Gram stain ใช้ไม่ได้กับ จุลินทรีย์ที่ไม่มีผนังเซลล์ เช่น  Mycoplasma และ Ureaplasma รวมทั้งกลุ่ม Spirochetes ที่ตรวจไม่ได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ปกติและจุลินทรีย์ที่มีชีวิตอยู่เฉพาะภายในเซลล์ของโฮสต์ เป็นต้น

วัสดุและอุปกรณ์ สำหรับการย้อม Gram stain

1. 1.สไลด์จะต้องเช็คด้วย alcohol 95% เพื่อกำจัดไขมัน ฝุ่น และ จุลินทรีย์  ก่อนนำมาใช้ทุกครั้ง
2. 2.สี Gram stain ต้องเก็บไม่ให้ถูกแสงโดยตรง
3. 3.ใช้ไอโอดีนชนิดคงตัว  (Stabilized iodine) เนื่องจากไอโอดีนทั่วไปจะเสื่อมสภาพ ร้อยละ 60% ภายใน 30วันถ้าเก็บไว้ในอุณหภูมิห้อง ไอโอดีนที่เสื่อมสภาพจะส่งผลให้แบคทีเรียชนิด Gram positive ติดสีไม่ดี

 การเตรียมสเมียร์ (Smear preparation)

                ป้ายตัวอย่างที่จะทำสเมียร์บนสไลด์โดยหมุนเป็นวงกลมไม่ให้หนาหรือบางเกินไป สเมียร์ที่หนาเกินไปเมื่อย้อมแล้วอาจมองเซลล์ของแบคทีเรียได้ยาก และ การติดสีอาจไม่ชัดเจน กรณีที่ตัวอย่างเข้มข้นมาก อาจแก้ไขโดยการหยดน้ำบนสไลด์ 1-2 หยดเพื่อเจือจางตัวอย่างก่อนทำสเมียร์ ส่วน สเมียร์ที่บางเกินไปอาจตรวจไม่พบเชื้อแบคทีเรีย

                ก่อนที่จะนำสเมียร์มาย้อมสีจำเป็นต้องผ่านขั้นตอน Fixation เพื่อนฆ่าเชื้อแบคทีเรียป้องกันไม่ให้เซลล์แตกขณะย้อมสีและทำให้สเมียร์ติดบนสไลด์ไม่หลุดออกขณะย้อมสี

                สเมียร์ที่เตรียมเสร็จแล้วต้องทำให้แห้งในอากาศ (air dry) ไม่แนะนำให้ใช้ความร้อนโดยเฉพาะจากเปลวไฟโดยตรง เพราะจะทำให้เซลล์แตกหรือเสื่อมสภาพ การติดสีจะผิดเพี้ยน การใช้ตู้ควบคุมอุณหภูมิอาจทำได้แต่อุณหภูมิไม่ควรเกิน  60 °C สเมียร์ที่แห้งแล้วจึงนำมาผ่านขั้นตอน Fixation โดยสารเคมี โดยใช้ 95-100% alcohol  แช่สไลด์ไว้ 1-2 นาที ก่อนปล่อยให้แห้งในอากาศ โดยไม่ต้องล้างด้วยน้ำหรือใช้ความร้อน

การย้อมสีสเมียร์สไลด์

                ขั้นตอนการย้อมสี Gran stain ประกอบด้วยสีพื้นฐาน ได้แก่สี crystal violet การใส่สารที่ช่วยให้สีติดดีขึ้น (mordant) Gram’s iodine การล้างสีพื้นฐานออก () ด้วย Alcohol – acetone และ การย้อมสีซ้ำ (Counterstain) ด้วยสี safranin หรือ basic fuchsin โดยมีขั้นตอนโดยทั่วไปดังนี้

1. 1.ใส่สี crytalลงบนสไลด์  ปล่อยทิ้งไว้ 1 นาที
2. 2.ล้างสีออกด้วยน้ำบริสุทธ์  (deionized water)
3. 3.ใส่ Gram’s iodine ลงบนสไลด์จนท่วมแล้ว ทิ้งไว้ 1 นาที
4. 4.ล้างอีกครั้งด้วยน้ำบริสุทธ์ เพื่อกำจัด Iodine
5. 5.หยด alcohol – acetone ลงบนบริเวณตัวอย่างที่ สเมียร์ ไว้บนสไลด์ เพื่อล้างสีส่วนเกินออก (ปกติใช้เวลาไม่เกิน 10 วินาที)
6. 6.ล้างสไลด์ด้วยน้ำบริสุทธ์เพื่อกำจัด alcohol – acetone ออกจากสเมียร์
7. 7.ใส่สี safranin หรือ basic fuchsin ลงให้ท่วมสไลด์ แล้วทิ้งไว้ 1 นาที
8. 8.ล้างสไลด์ด้วยน้ำบริสุทธ์เพื่อกำจัดสีส่วนเกิน แล้วปล่อยให้แห้งในอุณหภูมิห้อง
9. 9.นำมาตรวจหาแบคทีเรียด้วยกล้องจุลทรรศ กำลังขยาย1000เท่า แบคทีเรีย Gram positive จะติดสีม่วงแก่ส่วนแบคทีเรีย Gram negative จะติดสีชมพู

ข้อควรระวัง

1. 1.สเมียร์ที่หนาเกินไปจะทำให้ แบคทีเรีย ติดสีไม่แน่นอน โดยเฉพาะการติดสีเป็น Gram positive
2. 2.สเมียร์ที่เตรียมในสารละลายเข้มข้นมากเกินไป  (hypertonic) หรือ เจอจางมากเกินไป (hypotonic) รูปร่างเซลล์ของแบคทีเรียอาจเปลี่ยนไป
3. 3.สเมียร์ที่ทำให้แห้งด้วยความร้อนโดยตรง หรือใช้กล่องควบคุมอุณหภูมิที่อุณหภูมิสูงกว่า 60 °Cจะทำให้แบคทีเรียทั้งหมดติดสี  Gram negative
4. 4.แบคทีเรียบางชนิดอาจเปลี่ยนจาก Gram positive เป็น  Gram negative ได้ถ้าเก็บไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อนานเกินไป เช่น แบคทีเรียกลุ่ม Bacillus , Clostridium , Lactobacillus และ Staphylococcus เป็นต้น

เอกสารอ้างอิง

Kessy Pieru ; How wel do you know “The Gram Stain” Hardy Diagnostic (2016)